Congelazione di ovuli, vitrificazione delle ovocita

Congelazione di ovuli, vitrificazione delle ovocita

A. Crioconservazione dello sperma:

La congelazione del liquido seminale é una tecnica semplice e utile per conservare un campione di sperma per poterla utilizzare in futuro. La crioconservazione del seme si realizza nel seguente modo.

  • Raccolta del campione: Il paziente deve avere tra 3 o 4 giorni d’astinenza sessuale. Non é idoneo avere molti giorni in piú (i limiti sono: non meno di 2 e non più di 5 giorni).

Il campione deve essere raccolto tramite masturbazione presso la clinica dove verrá trattato lo sperma. Nel caso in cui si dovesse ottenere il campione dalla casa del paziente, non deve passare più di un’ora per la consegna in clinica e si dovrebbe mantenere il campione a temperatura corporea.
Il campione viene raccolto in un contenitore sterile dopo essersi lavate le mani cercando di non perdere nessuna parte del liquido seminale. Se questo dovesse accadere è necessario comunicarlo alla clinica.

  • Analisi del campione: Il laboratorio di andrologia effettuerá uno spermiogramma per determinare se il campione di liquido seminale è di qualità sufficiente per essere congelato.
  • Crioconsevazione le campione: una volta determinato che il campione é valido per essere congelato, verrá agguinto al campione un cryoprottettore e si congelerá con vapori di azoto liquido (-196 ° C), in paiette che saranno conservate nella banca del seme dove rimangono perfettamente identificate fino a quando sará neccessario per il loro utilizzo.

La crioconservazione é indicata nei seguenti casi:

  • Nei pazienti che devono essere sottoposti a chemioterapia o radioterapia e quindi e quindi ridurre o addirittura eliminare la capacità riproduttiva maschile o prima di sottoporsi a una vasectomia.
  • Nei trattamenti di riproduzione assistita (anche se è utilizzato campione fresco ), avere un campione congelato evita alcuni imprevisti e crea una maggiore tranquillità nella coppia, perché a volte, il giorno della fecondazione non è possibile avere un campione per diverse cause.
  • Quando c’é un progressivo deterioramento per cause note o ignote sulle caratteristiche degli spermatozoi. Col passare del tempo é possible che la qualità possa diminuire drasticamente incluso potrebbe raggiungere l’azoospermia.
  • Quando il numero di spermatozoi é molto basso che risulta consigliabile l’accumulo degli spermatozoi da diversi eiaculati, i quali saranno congelati ed utilizzati successivamente tutti insieme. Ad esempio in una inseminazione artificiale.

B. Crioconservazione delle ovocita.

Secondo una ricerca condotta a livello mondiale, la donna comincia a mostrare un calo della capacità riproduttiva dai 35 anni di età, con una diminuzione evidente della quantità e della qualità degli ovuli. É un poco ingiusto, perché questa è l’età in cui la donna è più stabile dal punto di vista psicologico, fisico, intellettuale e professionale.

Purtroppo questa è la natura femminile, in modo che già a 40 anni la riproduzione in modo naturale é improbabile e dai 43 anni quasi impossibile. Nella riproduzione assistita non è nota nessuna donna che sia stata madre, utilizzando i propri ovuli dai 45 anni di età.

I progressi nella cura per la fertilità hanno raggiunto prodezze in questa direzione e stanno permettendo alle donne di avere figli in età più avanzata di quanto la natura permette.

Uno dei modi per preservare la fertilità è quello di preservare il tessuto ovarico o ovociti (maturi o immaturi) per fecondarli e reinestarli rispettivamente, in futuro. Un’utopia che è già possibile.

Si tratta di congelare tessuto ovarico o vetrificare ovocita.

La crioconservazione del tessuto ovarico permette conservare direttamente parte della corteccia delle ovaie per poi essere reimpiantato nella paziente. Molti bambini sono già nati con questo metodo, i primi negli Stati Uniti.

La vetrificazione di ovociti sarebbe il metodo più facile ed efficace e consiste nello superaffreddamento dell’ovulo a velocità elevata, impedendo così la formazione di cristalli di ghiaccio all’interno dello stesso, dal momento che sono cellule con un elevato contenuto di acqua e tali cristalli danneggerebbero le strutture interne delle cellule causando loro la morte. Così, la sopravvivenza di questi ovociti sarà altamente efficace dopo lo scongelamento.

 

Nel momento in cui la donna decide che vuole diventare madre, si realizzerá la fecondazione delle ovocita, con un conseguente alto tasso di gravidanza, secondo i nostri risultati.

 

Così le donne possono conservare i propri ovuli sani e giovani ed utilizzarli in qualsiasi momento della vita. In questo modo si offre anche alle donne con cancro che devono ricevere radioterapia o chemioterapia la possibilità di avere il proprio bambino in futuro, ed è anche una alternativa per chi vuole rimandare la maternità, sia per motivi professionali o altro.

C. Crioconservazione di preimbrioni:

 

I pre- embrioni a 2-6 o 8 cellule che non vengono trasferiti nell’utero nel trattamento di riproduzione assistita, sono congelati, in vasche speciali, in azoto liquido a -196 ° C. Successivamente, sará possibile decidere il momento per scongelarli per il trasferimento all’interno dell’utero della paziente, essere donati ad altre coppie o donati per la ricerca, secondo i desideri della coppia.

Si consiglia di congelare solo embrioni di buona qualità. Dopo lo scongelamento, gli embrioni vengono lasciati in coltura per 24 ore per vedere se sono evolutivi poiché continueranno a dividersi.

In alcuni casi, durante lo scongelamento alcuni blastomeri dell’embrione potrebbero morire. È stato osservato che devono rimanere almeno la metà più un blastomero vivo , affinché l’embrione sia evolutivo. Cioè, se l’embrione prima del congelamento era di 8 cellule, nello scongelamento devono sopravvivere almeno 5 cellule . E soprattutto, lasciarlo per 24 ore in cultura per vedere se continua a dividersi.

Si è riscontrato che il congelamento degli embrioni non ha effetti negativi sul tasso di anomalie alla nascita ( 1,8 % ) e se c’è un buon metodo di congelamento degli embrioni, il tasso di gravidanza è molto accettabile, e ci sono meno rischi di gravidanze multiple.

I transfert di embrioni congelati possono essere eseguiti sia in cicli naturali che artificiali o sostitutivi, nei quali si utilizzano ormoni per la preparazione dell’endometrio (estrogeni e gesta-geni).

 

Il processo di congelazione

La legislazione spagnola prevede l’obbligo di crioconservare tutti gli embrioni vitali in sovranumero ottenuti dal ciclo di riproduzione assistita. Inoltre, i centri di riproduzione assistita devono essere equipaggiati con le risorse umane e materiali necessarie, nonché le risorse tecniche adeguate e di un assicurazione obbligatoria per le banche di pre-embrioni.

Vi è un documento informativo ed un consenso del processo che i pazienti devono compilare prima del trattamento, in ogni caso se ci sono embrioni congelati, essi appartengono alla coppia per un periodo di cinque anni e alla fine del quale, se la coppia non esprime interesse per loro, diventeranno di proprietà della clinica di fertilità di modo che tali embrioni siano inseriti nel programma di donazione di embrioni.

Sia la congelazione dei pre-embrioni che il possibile destino dei pre-embrioni congelati sono regolati dalla Legge 14/2006 del 26 maggio sulle tecniche di riproduzione umana assistita.

In quanto all’aspetto tecnico e biofisico della crioconservazione cellulare, essa richiede previamente disidratare la cellula il piú possibile, al fine di evitare durante il processo la formazione di cristalli di ghiaccio al suo interno che potrebbero danneggiarla. Per Per ottenerlo verranno utilizzate sostanze crioprotettrici che sostituiscono l’acqua che esce dalla cellula inserendo il crioprotettore. Questi agenti crioprotettori denominati permeabili sono 1,2-propandiolo ( PROH ) , dimetilsolfossido ( DMSO) e glicerolo. In genere possono essere utilizzati in combinazione con altri crioprotettori non permeabili, come saccarosio, che agisce esercitando un effetto iperosmolare. Per cercare di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari, si procede all’’induzione della formazione di ghiaccio in un posto lontano dalle cellule o embrioni, un processo noto come seeding. Infine, di solito è aggiunto al mezzo di congelamento albumina per impedire l’indurimento della zona pellucida che durante il processo di congelamento diventa piú dura.

I risultati in termini di sopravvivenza nei pre-embrioni scongelati possono variare tra il 60-80% ed i tassi di gravidanza tra 30-60% dipendendo dai diversi trattamenti.

D. Crioconsevazione di preembrioni e pronuclei:

Il protocollo di congelamento per gli embrioni in fase iniziale di sviluppo, cioé in stadio pronucleo, è simile a quello utilizzato per gli embrioni ma con altri tempi nella rampa di congelamento.Inoltre, vengono applicate tutte le considerazioni che sono state indicate nel congelamento degli embrioni, sia in termini di rigore per i tempi di attuazione e temperature,sia ponendo gli embrioni sulla paiette, sia la realizzazione del seeding e la velocitá della localizzazione degli embrioni nella loro contenitore di stoccaggio. Tutti questi fattori influenzano la sopravvivenza degli embrioni per ottenere la gravidanza.

Se gli embrioni da congelare sono di scarsa qualità, la sopravvivenza e la probabilitá di impianto sarà bassa.

I risultati in termini di sopravvivenza nella scongelazione nei pre-embrioni di due pronuclei può variare tra 80-100% ed i tassi di gravidanza tra il 50-80% dipendendo dai diversi trattamenti.

 

E. Crioconservazione di blastocisti:

L’embrione blastocisto è una struttura embrionaria presente nelle prime fasi di sviluppo durante la gravidanza (embriogenesi), che si verifica circa 5 o 6 giorni dopo la fecondazione e prima dell’impianto nell’endometrio. È formata da una cavità prominente e tra 70-100 cellule. Le cellule del blastocisto sono pluripotenti, cioè le cellule della massa cellulare interna possono convertirsi in qualsiasi tipo di tessuto.

Solo tra il 40 e il 60% degli embrioni raggiungiungono lo stadio di blastocisto, di modo che, il numero di embrioni trasferiti o congelati é ridotto.

In realtà, il coltivo e la congelazione dei blastocisti nei programmi di fecondazione in vitro iniziarono nei primi anni ’90, quando i mezzi di coltura sono stati ottimizzati ed è stato possibile ottenere buoni blastocisti con i co-coltivo. Dopo ci fu una piccola transizione ed adattamento utilizzando terreni di coltura sequenziali.

Fin dall’inizio, il congelamento dei blastocisti è stato effettuato in glicerolo con protocolli lenti con piú passaggi di modo che si producesse una buona diffusione del crioprotettore, visto che il numero di cellule è aumentato e cambia così il rapporto superficie / volume. Tuttavia, ora si utilizzano protocolli corti in due passaggi con glicerolo e saccarosio con uguali o migliori risultati.

Noi per la crioconservazione di blastocisti utilizziamo la vetrificazione costituito da una diminuzione della temperatura ultraveloce che “solidifica” il blastocisti con un risultato del tasso di gravidanza clinica del 59%.

Come succede con embrioni di 4-8 cellule, la qualitá dei blastocisti che si congelano segnerá il risultato che si otterrá quando verranno scongelati, ossia una migliore qualità dei blastocisti (blastocisti giorno 5 o 6, massa cellulare espansa ed interna di buona qualità) maggiore probabilità di successo.

Allo stesso modo, è necessario lasciare un tempo di incubazione di almeno 4 ore per finire lo scongelamento, per dare tempo al blastocisto di recuperarsi e si possa osservare la sua sopravvivenza, prima di essere trasferito nell’utero.

 

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